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磺胺五合一
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺類藥物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物磺胺類藥物的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物磺胺類藥物的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 1ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min~15min
u 樣本檢測下限
組 織（高 檢 測 限 方 法） ············· 1ppb
組 織（低 檢 測 限 方 法） ·············· 5 ppb
蜂 蜜 ·············································· 1ppb
血 清 、 尿 液 ······························ 4 ppb
牛 奶 ······································ 20 ppb
u 交叉反應(yīng)率
磺胺嘧啶（SD或SDZ） ····················· 100.0%
磺胺間甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）····97.6%
磺胺甲噁唑（SMZ） ···························· 100%
磺胺噻唑（ST） ································ 195.0%
磺胺甲基嘧啶（SM1 ） ························ 92%
u 樣本回收率
組 織 、尿 樣、牛 奶 ··············· 85% ±25%
蜂 蜜、血 清 ··························· 80% ±23%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 1ppb |
3ppb | 9ppb | ||
27ppb | 81ppb | ||
3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 20X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、正己烷、Na2HPO4·12H2O、一水合檸檬酸、濃鹽酸、NaOH
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配制：
配液1 0.2M NaOH溶液
稱取0.8gNaOH用去離子水100ml溶解。
配液2 0.5M鹽酸溶液
4.3ml濃鹽酸加入去離子水定容至100ml混勻。
配液3 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液
稱取19.85gNa2HPO4·12H2O與9.3g一水合檸檬酸，加去離子水定容至1L混勻。
配液4 乙腈-二氯甲烷混合溶液：
V乙腈：V二氯甲烷 = 1 : 4
配液5 樣本復(fù)溶液：
將20X濃縮復(fù)溶液用去離子水1：19稀釋。
u 樣本處理：
（a）組織高檢測限處理方法一
1、 稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；加入6ml乙酸乙酯，振蕩2min，4000r/min以上，15℃離心10min；
2、 取3ml清澈有機相至干燥容器中，50-60℃氮氣或空氣吹干；
3、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml?；旌?/span>30s，4000r/min以上15℃離心5min；去除上層正己烷；
4、 取下層50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍
（b）組織高檢測限處理方法二
1、稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；
2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；
3、取4ml有機相至干燥容器中，56℃氮氣吹干/旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；
4、用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上15℃離心5min；
5、去除上層正己烷，取下層50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)： 1倍
注：此方法與喹諾酮類組織前處理方法二合一。
（c）組織低檢測限處理方法
1、 稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；加入8ml 樣本復(fù)溶液，震蕩2min；4000r/min以上，15℃離心10min；
2、 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 5倍
（d）血清處理方法
1、 將血樣本于室溫放置30min，于10℃，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清；
2、 取1ml血清，加入3ml 樣本復(fù)溶液混合，混合30s；
3、 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 4倍
（e）蜂蜜處理方法
1、 稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M 鹽酸溶液置于37℃環(huán)境中30min；
2、 分別加入2.5ml 0.2M NaOH溶液和3ml Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，再加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，4000r/min以上室溫離心10min；
3、 取2ml上層有機相于50-60℃下氮氣吹干，加入0.5ml 樣本復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；
4、 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍
（f）尿液處理方法
1、 用3ml樣本復(fù)溶液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s；
2、 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 4倍
（g）牛奶處理方法
1、 取1ml牛奶樣本用樣本復(fù)溶液按1︰19（v/v）稀釋（即20µl牛奶+380µl 樣本復(fù)溶液），混合30s；
2、 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 20倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
u 測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb～81ppb；樣本2的濃度范圍是3ppb～9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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